魏晉南北朝時期，局勢動蕩中的西域各地依然與中原王朝或區域性政權保持著密切的一體化聯系。這一時期西域地區民族大遷徙局面的出現使該地區的民族成分更加復雜，各個部落集團和民族的活動交往，使該地出現了局部性的統一，為后來唐代統一天山南北各地奠定了政治基礎。這一時期大量涌現出來的色彩斑斕的西域文化成果在中國歷史上具有特殊的意義。   
    東漢滅亡以后，在西域政治舞臺上活動過并先后建立政權的古代民族主要有鮮卑、柔然、高車、峻噠和突厥等。他們給這一時期西域的政治衍變和經濟文化發展增光添彩。   
    這一時期中原地區對西域之管轄以三國時期的曹魏政權為最早，魏承漢制，曾分別于文帝黃初二年(公元221年)置西域戊己校尉，治設高昌(吐魯番)，于明帝太和年間(公元227—232年)復置西域長史，治設海頭(羅布淖爾東北)。根據史書記載，當時西域各地“無歲不奉朝貢，略如漢氏故事”。司馬炎建立西晉后，其治下之“涼州刺史領戊己校尉護西域，如漢故事，至晉不改”。晉朝在西域還設立“校尉”、“都尉”等職官，并給當地諸部落首領冊以爵位和封號，還經常向鄯善等地賞賜耕牛，幫助當地農民從事生產，以維護晉朝對天山南北各地的統治。這一時期，內地不少農民遷居西域，在此從事經商活動的漢人也很多。在鄯善的樓蘭、海頭等地發現了許多漢文木牘(音讀du)、木簡和紙文書，其中有一些明確標有晉朝皇帝的年號，表明漢字應當是該地當時流行的官方文字。除漢文之外，鄯善、于闐等當地民族還使用（馬+咼）盧文，這是一種公元前5世紀至公元4—5世紀流行于印度北部地區的古代文字，因為其字形同驢唇，我國俗稱“驢唇體”。經學者研究，（馬+咼）盧文約在公元3世紀前后傳人天山南部、昆侖山北部綠洲地帶，對于當地人們的社會生活影響很大，尼雅地區發現的（馬+咼）盧文書因為都是根據本地的發音拼寫的，所以被學者稱為（馬+咼）盧文尼雅俗語。除了文書，這一帶地區還出土了（馬+咼）盧文錢幣以及漢（馬+咼）二體錢幣等。（馬+咼）盧文的使用或許同佛教文化的東傳有關系，它還顯示了當時西域地區居民種族來源的多元性。   
    西晉之后，中原地區大亂，河西地區出現的割據政權，諸如漢族張氏前涼、氐族呂氏后涼、漢族李氏西涼、匈奴沮(音舉ju)渠氏北涼、鮮卑禿發氏南涼等政權都曾將其政治影響擴展到流沙以西(即西域)，天山南北各地又一度成為河西諸涼王朝疆域之一部分。西晉初年，中原地區戰亂不息，不少中原漢人經過河西走廊，逃難遷居高昌(吐魯番一帶)，高昌及周圍地區因此迅速繁興起來。至西晉末年，前涼政權創建者張駿發兵西征，討伐西晉設在高昌地區的西域戊己校尉趙貞，“(張)駿擊擒之，以其地為高昌郡”，此時為東晉咸和二年(公元327年)。高昌郡下設縣，縣下有鄉、里，郡置郡守，縣設縣令，鄉有薔夫，里有里正。這是西域推行內地通行的郡縣制的開端，它表明西域的政治管理體制與中原內地開始趨于一致。自此至北涼沮渠氏建國高昌后廢郡，中經前秦、后涼、西涼、段氏諸政權，高昌一直是涼州或沙州下轄的一個郡。